アガロースゲルの解釈方法

Posted on
著者: Randy Alexander
作成日: 2 4月 2021
更新日: 17 11月 2024
Anonim
アガロースゲル電気泳動
ビデオ: アガロースゲル電気泳動

コンテンツ

DNAサンプルをアガロースゲルで実行し、写真を撮影したら、後で写真を保存して、結果を分析して解釈することができます。探しているものの種類は、実験の性質によって異なります。たとえば、DNAの運指を行う場合、2つのサンプル(容疑者と犯罪現場のサンプルなど)からのDNAの断片のサイズを比較する必要があります。対照的に、バクテリア由来のプラスミドを使用する場合は、プラスミドにインサートが含まれていることを確認する必要があります。そのため、ゲルの解釈方法は、行った実験に一部依存します。それでも、適用できる一般的なルールがいくつかあります。

    画像の上部から始めて、ゲルの「標準」レーン(ラダーとも呼ばれます)の各バンドまでの距離を測定します。標準レーンにはサイズが既知のDNA断片が含まれているため、実験を開始する前にそれぞれのサイズをすでに知っている必要があります。また、各サンプルレーンのバンドが移動した距離を測定します。

    サンプルの各標準バンドと各バンドが移動した距離を、ゲルの底までの距離で割ります。その結果は、相対モビリティと呼ばれます。このステップがより速くなる場合は、スプレッドシートプログラムを使用して計算を行うことができます。

    各標準の相対移動度とサイズをスプレッドシートプログラムに入力し、スプレッドシートプログラムグラフ作成ツールを使用して、x軸に相対移動度、yにサイズを指定してこのデータのグラフを作成します。

    非線形回帰を使用して線をグラフに合わせます。これを行う方法を知る必要がある場合は、スプレッドシートプログラムのヘルプセクションを参照してください。おそらく次のような式になります。

    y =(0.3)x ^ -2.5

    ここでxは相対移動度であり、yはサイズであることに注意してください。また、方程式には指数と係数の数値が完全に異なる場合があることに注意してください。この方程式は、単なる例として提供されています。

    サンプルからバンドの相対移動度を取得し、xとして接続して、サンプルバンドのDNA断片のサイズを計算します。

    スプレッドシートプログラムによって導出された方程式が実際にy =(0.3)x ^ -2.5であり、特定のサンプルバンドの相対移動度が0.68であったとします。方程式に0.68を代入すると、次のことがわかります。

    y =(0.3)(0.68)^-2.5

    電卓を使用して、0.68を-2.5に上げて、次を見つけます。

    y =(0.3)(2.62)

    y = 0.786

    サンプルのバンドの1つに含まれるDNAの推定サイズ(キロベース)になります。

プラスミド

    このセクションの手順を使用する必要がある場合とそうでない場合があることに注意してください。アガロースゲル電気泳動は、プラスミドに特定のインサートが含まれていることを確認するためによく使用されます。プラスミドを使用していない場合は、このセクションをスキップできます。ただし、これらの手順に従うことができます。

    未切断またはニックの入ったプラスミドを使用している場合、上記セクション1の手順を使用してサイズを推定することはできません。それは、切断されていないニックの入ったプラスミドが線形DNAとは異なる速度で移動するためです。

    各レーンのバンドの数を比較します。制限酵素は、制限部位と呼ばれる特定の配列が生じる部位でDNAを切断することを思い出してください。サンプルが2つの制限酵素で処理された場合、インサートのバンドとプラスミドの残りのバンドの両方が存在するはずです。これは、インサートがそれぞれ異なる酵素に対応する2つの制限部位に隣接するため、これらの両方の部位で切断するとプラスミドからインサートが解放されるためです。対照的に、1つの部位のみでの切断は、プラスミドを線状DNAに変換します。制限酵素なしまたは1つの制限酵素を使用したサンプルカットは、単一のバンドを特徴とし、2つの制限酵素を使用したサンプルカットは、2つのバンドを特徴とします。

    ニックの入ったプラスミドDNAによって作成されたバンドを探します。ニックの入ったプラスミドは一本鎖のみに切断されているため、切断されたプラスミドよりもゆっくりと移動します。切断されたプラスミドは、切断されていないDNAよりもゆっくりと移動します。

    セクション1で説明されている手順を使用して挿入物のサイズを見積もり、それが予想と一致するかどうかを判断します(実験によって異なります)。