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分光測光法は、化学および生物学の貴重なツールです。基本的な考え方は単純です。異なる物質は、ある波長の光/電磁放射を他の物質よりもよく吸収します。たとえば、一部の素材は透明で、他の素材は色付きである理由です。溶液を通して特定の波長の光を照射すると、その濃度が高くなるほど、より多くの光が吸収されます。濃度を計算するには、測定値を既知の濃度の標準の測定値と比較する必要があります。以下の手順は、化学教育ラボを念頭に置いて作成されたかなり一般的な手順ですが、他の設定に合わせて変更することもできます。
ラボで作業するときはいつものように、ゴーグル、手袋、長袖のコートを着て、自分の安全を確保してください。
ゴム球を絞って空気を空にし、目盛り付きピペットの上に置いて、球根がリラックスして水がピペットに吸い込まれるようにします。次に、電球を取り外し、指でピペットの上部に蓋をします。これにより、ピペットが密閉され、指を離すまで内部の溶液が流出しなくなります。指の端をわずかに持ち上げて、希望する量になるまでピペットから少量の溶液を流出させます。いくつかの水とビーカーで練習して、目盛り付きピペットがどのように機能するかを感じてください。リソースセクションの下のリンクには、以前に作業したことがない場合にピペットを使用する方法を示すフィルムクリップがあります。
5つの試験管に標準1〜5のラベルを付けます。マスキングテープとペンを使用するか、ドライ消去マーカーを使用してラベルを付けることができます。
基準に合わせて5つの濃度を選択してください。標準濃度は、ほぼ同じ間隔（たとえば、0.1モル、0.2モル、0.3モルなど）で互いに分離し、未知と予想されるものとほぼ同じ範囲で分離する必要があります。とりあえず、次の5つの濃度を使用しますが、独自の実験を実行する場合はこれらを変更する必要があることに注意してください。
標準1：0.1モル標準2：0.2モル標準3：0.3モル標準4：0.4モル標準5：0.5モル
次に、1モルの標準液を取り、次の量を試験管1〜5に加えます。これらの量は上記の濃度を使用して計算されるため、独自の実験を実行する際に必要に応じて変更する必要がある場合があります。
標準1：0.8ミリリットル標準2：1.6ミリリットル標準3：2.4ミリリットル標準4：3.2ミリリットル標準5：4ミリリットル
メスピペットをすすぎ、次の量の脱イオン水を移します：
標準1：7.2ミリリットル標準2：6.4ミリリットル標準3：5.6ミリリットル標準4：4.8ミリリットル標準5：4.0ミリリットル
基本的に、アイデアは各チューブの溶液量を最大8ミリリットルにすることです。
各標準チューブにパラフィルムをかぶせ、反転させて混合します。
別の5つの試験管に「不明1〜5」のマークを付けます。標準用の1モル溶液で使用したのと同じ量の未知または試験溶液をそれぞれに追加します。つまり、不明1には0.8ミリリットルのテスト溶液と7.2ミリリットルの水が含まれ、不明2には1.6ミリリットルのテスト溶液と6.4ミリリットルの水が含まれます。
未知のそれぞれをパラフィルムで覆い、注意深く反転させて混ぜます。
分光光度計の電源を入れ、ウォームアップできるようにします。必要な時間の長さは、モデルとメーカーによって異なります。
分光光度計で波長を設定します。波長は実験の化学物質の種類によって異なります。今のところ、500 nmを想定していますが、さまざまな実験のためにこれを変更する必要があることを覚えておいてください。
分光光度計を較正します。キャリブレーション手順は、使用しているデバイスによって異なります。教育ラボの一般的なモデルであるSpectronic 20では、キュベットが装填されていないときに「0パーセントT」になるようにマシンを調整し、次に脱イオン化された空のキュベットに「100％T」水のみが投入されます。これらの手順は、使用しているマシンの種類によって異なる場合があるため、詳細については製造元の指示を参照してください。
機械の較正後、標準の1本の試験管を取り出し、内容物が充填ラインに達するまできれいなキュベットに注ぎます。キムワイプでキュベットを拭いて、指やその他の汚れを取り除きます。キュベットを分光光度計に挿入し、「％T」の測定値を記録します。
10個すべてのサンプルに対してこの手順を繰り返します。結果が可能な限り正確であることを確認するために、サンプル間でキュベットをきれいにすることを確認してください。
標準の結果を取得し、ExcelやOpenOfficeなどのスプレッドシート/グラフ作成プログラムに入力します。
スプレッドシートプログラムを使用して、標準の各「％T」値で100％を割り、結果のログを取得します。この計算により吸光度が得られます。数式を入力すると、スプレッドシートプログラムが計算を行います。
例：％Tが50.6の場合、スプレッドシートプログラムに入力する式は次のようになります。
ログ（100 / 50.6）
スプレッドシートプログラムが計算を行います。
5つの未知/実験値すべてに対して同じことを行います。
x軸に濃度、y軸に吸光度を使用して、5つの標準すべての吸光度値をグラフ化します。スプレッドシートプログラムを使用して、このグラフに線形方程式を当てはめます。方程式は、y = mx + bの形式になります。ほとんどのスプレッドシートプログラムには線形回帰関数があります。線形回帰機能の使用方法の詳細については、スプレッドシートプログラムのユーザーマニュアルを参照してください。
スプレッドシートプログラムから最適な線の方程式を取得し、両側からbを減算し、両側をmで除算してyを求めます。結果は次のようになります。
（y-b）/ m = x
bとmは、スプレッドシートプログラムで検出された値です。
未知の吸光度値を確認し、標準とほぼ同じ範囲にある3つを選択します。残りの計算には、これら3つの吸光度値を使用します。 5つすべてが標準と同じ範囲内にある場合、代わりに5つすべてを使用できますが、少なくとも3つを使用する必要があります。
yの代わりに、3つの吸光度値をそれぞれ方程式に差し込みます。方程式は次の形式であったことに注意してください。
（y-b）/ m = x
したがって、各未知の吸光度値をyの代わりに方程式に代入し、xを計算します。スプレッドシートプログラムを使用して、この計算を行い、より速くすることができます。これで、希釈された3つの未知物質の対象化学物質の濃度が計算されました。ただし、元の溶液はこれらの未知物質を調製するために希釈されたので、逆算して、希釈係数に基づいて元の溶液の濃度を計算する必要があります。
分光光度計に挿入した未知の各サンプルは、異なる量で希釈されました。したがって、未知の各読み取り値の吸光度に基づいて計算した濃度を次のように分割する必要があります。
不明1：0.1で割る不明2：0.2で割る不明3：0.3で割る不明4：0.4で割る不明5：0.5で割る
ただし、これらの数値は、上記の希釈を使用しているという仮定に基づいていることに注意してください。サンプルを異なる量で希釈した場合は、これらの値を忘れずに変更してください。
結果をまとめて、結果の数で割ります。これにより、平均が得られます。この数値を、元の溶液の濃度の発見として報告してください。