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分子クローニングは、すべての学生と研究者が精通しているべき一般的なバイオテクノロジー手法です。制限酵素と呼ばれる種類の酵素を使用して分子DNAをクローニングし、ヒトDNAを断片に切断してから細菌細胞のプラスミドDNAに挿入できるようにします。制限酵素は二本鎖DNAを半分に切断します。制限酵素に応じて、切断により粘着末端または平滑末端が生じる可能性があります。スティッキーエンドは、ヒトDNAフラグメントがプラスミドに正しい方向で挿入されることを保証するため、分子クローニングにおいてより有用です。ライゲーションプロセス、またはDNAフラグメントの融合では、DNAの末端が粘着している場合、必要なDNAは少なくなります。最後に、複数のスティッキーエンド制限酵素は、各酵素が異なる制限シーケンスを認識している場合でも、同じスティッキーエンドを生成できます。これにより、粘着末端酵素によって目的のDNA領域が切り取られる可能性が高くなります。
制限酵素と制限サイト
制限酵素は、二本鎖DNA上の特定の配列を認識し、その配列でDNAを半分に切断する酵素です。認識された配列は制限部位と呼ばれます。制限酵素は、DNAの両端の間の位置でDNAが通常存在する方法である二本鎖DNAを切断するため、エンドヌクレアーゼと呼ばれます。 90種類以上の制限酵素があります。それぞれが個別の制限サイトを認識します。制限酵素は、認識できない他の部位よりもそれぞれの制限部位を5,000倍効率的に切断します。
正しい方向
制限酵素には2つの一般的なクラスがあります。彼らはDNAを粘着性末端または平滑末端に切断します。粘着性の末端には、DNAの構成要素であるヌクレオチドの短い領域があり、それは対になっていません。このペアになっていない領域は、オーバーハングと呼ばれます。オーバーハングは、相補的なオーバーハングシーケンスを持つ別のスティッキーエンドが必要であり、ペアになるため、スティッキーであると言われます。スティッキーエンドは、一度会ったらお互いをしっかりと抱きしめようとする、失われた双子のようです。一方、2つのDNA鎖間ですべてのヌクレオチドがすでに対になっているため、平滑末端は粘着性がありません。スティッキーエンドの利点は、ヒトDNAの断片が細菌プラスミドに一方向にしか適合しないことです。対照的に、ヒトDNAと細菌プラスミドの両方に平滑末端がある場合、ヒトDNAはプラスミドに頭から尾または尾から頭に挿入できます。
スティッキーエンドの結紮に必要なDNAが少ない
スティックエンドを持つDNAは、「スティッキネス」があるため、お互いを見つけるのは簡単ですが、スティッキーエンドもブラントエンドも融合して連続したDNAの断片になることはありません。完全にリンクされたDNAの連続部分の形成には、リガーゼと呼ばれる酵素が必要です。リガは、粘着性または平滑末端でヌクレオチドのバックボーンを接続し、ヌクレオチドの連続チェーンをもたらします。スティッキーエンドは、互いに引き合うために互いに早く検出されるため、結紮プロセスでは、ヒトDNAとプラスミドDNAが少なくて済みます。 DNAとプラスミドの平滑末端はお互いに見つけにくいため、平滑末端のライゲーションには、より多くのDNAを試験管に入れる必要があります。
異なる酵素は同じ粘着性の終わりを与えることができます
制限部位は生物のゲノム全体にありますが、等間隔ではありません。プラスミドでは、それらは互いに隣り合うように設計することができます。ヒトゲノムからヒトDNAの断片を切り取りたい科学者は、断片の領域の前後にある制限部位を見つける必要があります。 DNAフラグメントが正しい方向に挿入されることを保証することに加えて、異なる制限配列を認識する場合でも、異なる粘着末端酵素は同じ粘着末端を作成できます。たとえば、BamHI、BglII、およびSau3Aは異なる認識シーケンスを持ちますが、同じGATCスティッキーエンドを生成します。これにより、目的のヒト遺伝子に隣接する粘着末端制限サイトが存在する可能性が高まります。