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グラム染色は、染色色に基づいてどの細菌がグラム陽性またはグラム陰性であるかを示す差別的な染色手順です。アセトンアルコールは、このプロセスで色の区別を提供するために使用される1つの試薬です。グラム陽性菌は厚いペプチドグリカン層を持ち、紫色に染まりますが、グラム陰性菌はペプチドグリカン層がほとんどまたはまったくなく、ピンク色に染まります。
プライマリステインクリスタルバイオレット
細菌サンプルのスライドが準備されたら、クリスタルバイオレットを使用して最初にサンプルを染色します。この時点で、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方が紫色に見えます。通常、余分な汚れを水で洗い流す前に、クリスタルバイオレットをスライドに30秒間適用します。クリスタルバイオレットはペプチドグリカン層にわずかに付着する可能性があるため、すべての主要な染みが水で洗い流されるわけではありません。
媒染剤ヨウ素
次に、ヨウ素を1分間サンプルに添加します。それは媒染剤として機能し、染色プロセスで染料を固定するのに役立ちます。ヨウ素は、クリスタルバイオレットに結合して、クリスタルバイオレットだけよりもグラム陽性細菌細胞に見られる厚いペプチドグリカン層によりよく付着する不溶性複合体を作成することにより、この機能を実行します。ヨウ素を加えた後、水で洗浄するステップはありません。
脱色剤-アルコール
アセトンまたはエチルアルコールを脱色剤として使用できます。アルコールは、グラム陰性菌の外側の細胞膜にある脂質を溶解し、クリスタルバイオレット-ヨウ素複合体がより薄いペプチドグリカン層から漏れることを可能にします。アルコールは10〜20秒間加えられます。すべてのヨウ素が洗い流され、流出液が無色になるまでスライドに注がれます。グラム染色プロセスのこの時点では、グラム陰性菌は無色ですが、グラム陽性菌はクリスタルバイオレットを保持しています。終了したら、脱色効果を止めるためにスライドを水ですすぐ必要があります。
Counterstain-Safranin
次に、サフラニンを添加して、無色のグラム陰性菌との視認性とコントラストを高めます。汚れは、これらの細菌を顕微鏡下でピンク色に見せます。サンプル全体に染みが追加されるため、グラム陽性菌も染みますが、クリスタルバイオレットの色が濃いほど、サフラニンピンクの色が薄くなります。スライドサンプルにサフラニンを約1分間浸した後、水を使用して、細菌細胞に付着しなかった余分な汚れを洗い流します。